基于矿物元素指纹分析中国地理标志猪肉的产地溯源

近年来，特色地理标志农产品受到消费者的青睐。我国高端猪肉的推广具有地域性。目前市场上推广了许多地理标志猪肉，比如北京黑六、莱芜猪、巴彦猪肉等。地域特色猪肉的产地保护，是保障其品质的重要方法，可使企业与消费者建立信赖关系。产地溯源是产地保护的重要手段。现在报道的产地溯源技术主要有稳定同位素溯源技术[1]，矿物元素指纹分析技术[2]，近红外光谱技术[3]，核磁技术[4]，有机成分指纹分析[5]，DNA 技术等[6-8]。

矿物元素分析被认为是食品产地溯源最为可靠的技术手段之一[9]。生物体内的矿物元素组成受气候、环境、生物代谢类型等因素的影响。在不同地理生态环境下，生物体中矿物元素含量存在差异。矿物元素含量与多元统计分析结合，是实现矿物元素评估验证生物样品来源的重要手段。常采用的统计分析手段有方差分析、多重比较分析、主成分分析、聚类分析、判别分析等[10-13]。

目前国内该类技术大多应用在植物源性农产品中，比如水果蔬菜、谷物、茶叶等[14-17]。在动物源性食品中的应用主要有羊肉[18,19]，牛肉[20,21]，鸡肉[22,23]等。目前矿物元素指纹技术应用到猪肉产地溯源的研究较少。猪的饲养方式存在差异性和复杂性，目前，有研究探索喂养方式与猪肉中矿物元素含量之间的相关性[24,25]。这些研究可以为猪肉的产地溯源提供一定依据。韩国的Kim Kyong Su 在猪肉产地溯源方面研究较多[26-28]。2017 年，Kim Kyong Su 通过猪肉中多种矿物元素含量将韩国猪肉与进口的美国、德国、澳大利亚、荷兰、比利时的猪肉进行了区分，判别率达到97%。2018 年，Kim Kyong Su 将矿物元素和碳氮同位素比率联用对韩国和非韩国的猪肉进行判别，判别率达到了100%。目前我国对猪肉的产地溯源研究较少。地理标志猪肉为保证其地域属性，一般不存在异地调种、异地育肥的问题。因此地域信息的干扰少，矿物元素指纹分析可作为其产地溯源的可靠技术手段。

本文主要针对具有特色地域标志的高品质猪肉开展研究。通过对四川巴山的青峪黑猪肉，山东莱芜黑猪肉和北京黑六猪肉中33种矿物质元素含量进行统计分析，初步探索矿物元素含量在中国地域特色猪肉产地溯源中应用的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试猪肉材料为四川青峪黑猪后腿肉（n=10）（巴中市巴山牧业股份有限公司），山东莱芜黑猪后腿肉（n=6）（得利斯集团莱芜畜牧科技有限公司）和北京黑六黑猪后腿肉（n=10）（北京黑六牧业科技有限公司）。

浓硝酸（优级纯）、30%双氧水（优级纯），国药集团化学试剂有限公司；33种元素多元素混标（10 µg/mL），SCP SCIENCE；去离子水（电阻率18.2 MΩ·cm，20 ℃），费尔德Field-X 纯水机；In、Ge、Rh、Re 单元素标准溶液（1000 mg/L），Inorganic Ventures。

1.2 仪器与设备

TOPEX+智能型微波消解仪，上海屹尧仪器科技发展有限公司；ICAP RQ电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS），赛默飞世尔科技。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

取新鲜猪后腿肉瘦肉部分，切成小块，放入绞肉机绞拌均匀。称取0.5000 g 左右样品，置于微波消解管中，加入6 mL 硝酸和2 mL 双氧水，按照微波消解程序进行消解。消解后得到澄清溶液，赶酸后用超纯水定容至15mL，待测，高含量元素经稀释后测量。饲养用水，取5 mL 加2 mL 硝酸，按照微波消解程序进行消解，赶酸后用超纯水定容至15 mL 待测，高含量元素经稀释后测量。每个样品称量2 个平行试样。微波消解升温条件如表1 所示。

表1微波消解条件
Table 1 Temperature programming of Microwave Digestion

1.3.2 样品分析

测定样品中Na、K、Mg、Ca、B、Ti、Al、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、As、Se、Rb、Li、Be、V、Cr、Ni、Mo、Ag、Cd、Sr、Sn、Sb、Ba、La、Ce、Pb、U、Tl、Bi 共33 种元素含量。

用外标法进行定量分析，用10 µg/L Rh、Re、In、Ge 内标元素保证仪器的稳定性。ICP-MS 仪器条件如表2 所示。

表2ICP-MS 仪器条件
Table 2 Instrument Conditions of ICP-MS

表333种元素检出限
Table 3 Detection Limit of 33 elements

表4 不同产地猪肉中无机元素含量
Table 4 Elements concentration of pork from different origins

注：表格中的数值用平均值±标准偏差表示。

1.4 数据处理

检出限的测定：在与分析实际样品完全相同的条件下，连续测量试剂空白11 次，计算试剂空白观测值的标准偏差Sb，3 倍Sb 除以标准曲线斜率b，即为方法检出浓度。按照称样量0.5g，定容体积15 mL 计算得出方法检出限。应用安捷伦MassProfiler Professional软件对数据进行方差分析和主成分分析以及支持向量机、决策树、朴素贝叶斯、神经网络的分类分析；用Excel 对数据进行多重比较分析[29]；用上海易算生物科技有限公司的悟空：快速查看与分析数据云平台对数据进行PLS-DA 和OPLS-DA 判别分析（https://www.omicsolution.org/wkomics/main）。

2 结果与讨论

2.1 猪肉中元素含量分析

2.1.1 猪肉中各元素含量

ICP-MS具有灵敏度高，可同时分析多种元素，分析耗时短等优点。ICP-MS法目前成为多元素测定领域最先进，最准确的分析方法。肉类样品中无机元素含量最多的是钾，其次是钠，多价金属镁、钙、锌、铁的含量也较多，其他的金属含量较少。含量少的元素，有的低于或接近检出限，不适用于元素含量的测定和分析。因此本文分析了该测定方法各元素的检出限，以排除猪肉样品中含量低于或接近检出限的元素。各元素检出限见表3。根据各元素检出限，筛选出Ca、Ti、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、Se、Rb、Sr、K、Na、Mg 共13个元素进行统计分析。以上13种元素含量见表4。数据显示，猪肉样品中，K 含量最高，一般在3000～3500 mg/kg，其次是Na，含量在300～500 mg/kg 之间，然后是镁，含量在200～250 mg/kg 之间，Ca、Fe、Zn 含量为几十毫克每千克，Rb 和Sr 含量为几毫克每千克，其他元素含量较低。每种元素含量的变异系数均不大，说明猪肉样品个体间矿物元素含量受干扰因素影响较小，样本的代表性相对合理。

2.1.2 猪肉样品中矿物元素的地域差异性分析

对13 种元素含量数据进行方差分析，结果显示，样品中Na、Fe、Co、Cu、Zn、Se、Rb、Sr 共8 种元素在地域之间差异显著（p＜0.05）。LSD 法多重比较分析结果见表5，其中LSD0.05表示显著水平为0.05 时的最小显著差。计算两组平均数的差值（ӯa-ӯb），如其绝对值大于LSD0.05 即表示在0.05水平上差异显著；反之，则在0.05 水平上差异不显著。如果差异显著，两组平均数差值为正，则a 组显著高于b 组，反之，则a 组显著低于b 组。LSD0.05代表差异显著差值，LSD0.01代表差异极显著差值。结果显示（见表5），四川青峪猪肉中Se 和Na 含量显著极高于其他两地猪肉。这主要是受地理条件的影响。从各养殖基地采集的饲养用水中元素含量结果显示（结果见表6），四川青峪猪肉饲养用水中Na 含量明显高于其他两地。从我国农业科学研究院发布的中国土壤硒元素含量分布图中可以看出，四川达州位于四川东部大巴山腹心地带，地处川渝鄂陕四省市结合部，土壤富硒。莱芜黑猪肉中Co含量显著高于其他两地猪肉，与饲养用水中Co元素含量结果显示一致。莱芜黑猪肉中Rb 和Sr 含量显著低于其他两地猪肉，北京黑六猪肉中Zn 和Fe 含量显著低于其他两地猪肉，这些结果可能与其他环境因素息息相关。

表5 LSD 法多重比较分析结果表
Table 5 LSDmethod multiple comparison analysis results

注：表格中LW 代表莱芜黑猪，HL代表北京黑六黑猪，QY 代表四川青峪黑猪。

表6 不同产地猪饲养用水中无机元素含量
Table 6 Elements concentration in feeding water of pork from different origins

注：表格中的数值用平均值±标准偏差表示，“/”未检出。

2.2 猪肉中元素含量的主成分分析

主成分分析通过降维的作用，利用少数的几个综合指标反映众多指标的信息，从而把样品中多元素信息更直观的表现出来。通过主成分分析的结果也可以判断筛选的特征元素的差异情况。对在2.1中筛选出的，猪肉中具有地域间显著差异的8 种元素进行主成分分析。结果表明（见图1），前三个主成分的方差贡献率分别为53.33%、26.11%、9.00%，累计方差贡献率达到88.44%，能够达到充分反映原始数据信息的目的。从前三个主成分的3D得分图可以看出，利用第一主成分、第二主成分、第三主成分可以区分不同地区的猪肉样品。从主成分的特征向量（表7）可以看出，其中第一主成分主要综合了样品中Na、Fe、Co、Cu、Zn 和Se 六种元素含量的信息。第二主成分主要综合了样品中Rb 和Sr 含量的信息。第三主成分主要综合Na、Co、Cu 和Se 元素含量的信息。

表7 第一、第二和第三主成分的载荷
Table 7 Loading of first three principal components PC1, PC2, PC3

2.3 产地的不同分类模型分析

2.3.1 偏最小二乘法判别分析和基于正交信号校正的偏最小二乘判别分析

偏最小二乘法判别分析是一种用于判别分析的多变量统计分析方法。PLS-DA 和OPLS-DA 对于小样本量和较少自变量的数据的分析具有一定的优势。图2中橘色区域LW 代表莱芜黑猪，蓝色区域HL 代表北京黑六，灰色区域QY 代表青峪黑猪。从图2 中可以看出，橘色区域和灰色区域有重叠部分，且较为分散。采用留一法进行交叉验证，从交叉检验结果（见表8）可以看出，虽然北京黑六和四川青峪黑猪的预测完全正确，但莱芜黑猪被错误预测到其他组中。与PLS-DA 相比较，OPLS-DA 加了正交校正之后数据检出假阳性会降低，所以会更准确。图3 中绿色区域QY代表青峪黑猪，红色区域LW 代表莱芜黑猪，蓝色区域HL代表北京黑六。从OPLS-DA 得分图中能明显看出三地猪肉样品被完全区分开。其中R2X 和R2Y 表示模型与实验观测值的相关性，即表示拟合程度的好坏，R2越接近1 模型对样本的拟合能力越强，相关性越大。Q2Y 则为通过交叉验证计算得出，用以评价模型的预测能力，数值越接近1 说明模型预测能力越好，通常情况下，R2、Q2Y 高于0.5较好，且两者差值越小代表预测结果与实际结果越接近。RMSEE 表示模型的计算值与样本真实值的偏离度。RMSEE 越小越好[31]。评价模型优劣的统计量分比为R2X=0.854，R2Y=0.809，Q2Y=0.771，RMSEE=0.208。OPLS-DA判别方法可以得到100%的交叉验证准确率。综合看来模型并未过拟合，且有较好的预测能力。

图1第一、第二和第三主成分标准化3D 得分散点图
Fig.13DScore Scatter plot of first three principal components
PC1, PC2 and PC3

图2第一、第二主成分PLS-DA 得分图
Fig.2Score Scatter plot of first two principal components PC1 and PC2

图3第一、第二主成分OPLS-DA 得分图
Fig.3Score Scatter plot of first two principal components PC1 and PC2

表8PLS-DA 对不同产地猪肉判别结果表
Table 8 PLS-DA discriminant result table for pork from different producing areas

表9不同分类模型的交叉验证结果
Table 9 Accuracy of the prediction algorithm by cross-validation

表10 不同分类模型的外部测试集验证结果
Table 10 Accuracy of the prediction algorithm by External validation set

2.3.2 其他分类模型我们还应用支持向量机（Support Vector Machine）、决策树(Decision Tree)、朴素贝叶斯（Naive Bayes）和神经网络（Neural Network）四种分类方法，建立预测模型，考察其预测的准确率。采用留一法进行交叉验证，测试算法准确性。其中支持向量机的交叉验证结果的准确率为100%，决策树的交叉验证准确率为88.46%，朴素贝叶斯的交叉验证准确率为92.31%，神经网络的交叉验证准确率最低。此外，林昕等[30]在研究化学计量学工具在基于矿物元素指纹分析的茶叶产地溯源中应用的结果也显示，神经网络的验证准确率一般相较于决策树要低。通过外部验证数据验证模型的准确性。验证结果显示（见表10），决策树分类模 型能够将三个类别的样品全部准确归类。四种分类模型中，决策树分类模型结果最优，这也与林昕等[30]的研究结果一致。

3 结论

3.1通过对三种不同地域来源的地理标志猪肉中矿物元素含量的测定，结合统计学分析，筛选出有效地域判别元素指标，初步确定了矿物元素指纹分析对我国猪肉产地溯源的可行性。根据肉类样品中某些矿物元素含量极低的特点，通过检出限的测定，筛除了一些含量极低的不适合做统计分析的元素指标。通过方差分析，筛选出Na、Fe、Co、Cu、Zn、Se、Rb、Sr共8 种元素在三地猪肉之间差异显著。通过多重比较分析，将各元素间差异与地理环境因素相互对应。为了进一步了解和验证利用矿物元素含量对特色地域猪肉进行产地溯源的可行性，用8 个具有地域显著差异的元素构建分类模型。判别分析是一种根据观察或测量到的若干变量值，来判断研究对象如何分类的常用统计分析方法。我们选择了PLS-DA，OPLS-DA，支持向量机、决策树、朴素贝叶斯和神经网络六种分类方法。对比发现，OPLS-DA 和支持向量机交叉验证准确率达到100%，较适合应用于利用矿物元素指纹分析的特色猪肉产地溯源。通过结合矿物元素含量分析和化学计量学分析手段，可实现三个不同地域来源的地理标志猪肉的产地溯源。

3.2 本研究通过对小样本和地理区分明显猪肉样本进行初步探索研究，得到矿物元素指纹分析可较好的进行地域判别的效果。矿物元素指纹分析是一种有效的溯源技术，能够反映环境地理因素差异，该技术对我国猪肉进行产地溯源研究可靠性高，在我国猪肉的产地溯源和特色地理标志性猪肉保护中具有广泛应用前景。